抗體純化磁珠

1.抗體純化磁珠試劑盒是否可以重復(fù)使用？
答：不推薦重復(fù)使用，不同樣本之間容易造成污染。

2.若體系中含有木瓜蛋白酶，是否影響磁珠的使用？
答：木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，目前對protein A的影響未知，建議客戶慎用。

3.1mL抗體純化磁珠能夠用多少次?
答：1mL磁珠能夠結(jié)合1.5-2.0mg抗體，客戶需要根據(jù)結(jié)合抗體的量來確定使用磁珠的量。

4.試劑盒中的緩沖液用完后，能否告知配方？
答：試劑盒中緩沖液的成分都是保密的?？梢圆捎靡韵碌木彌_液進行替代。
結(jié)合緩沖液:PBST
150mM PBS，150mM NaCl，0.1% (v/v) Tween-20，pH7.2

洗脫緩沖液:甘氨酸緩沖液
0.1M Glycine，0.1% (v/v) Tween-20，pH2.5（該緩沖液適合于耐酸性的抗體）。
0.1M Glycine，3M MgCl2 (4M protein A/G) ，0.1% (v/v) Tween-20，pH4.5（該溶液含較高濃度的鹽，不可直接進行SDS-PAGE?？梢杂猛肝龌虺瑸V的方法去除過多的鹽）。

保存緩沖液：
50mM Tris-HCl，0.1%(v/v) Tween-20，0.01%(w/v) NaN3，pH7.5

洗滌緩沖液：
50mM Tris-HCl，0.1%(v/v) Tween-20，pH7.5）

再生緩沖液：
1% (v/v) TritonX-100

His-tag蛋白純化篇
1.蛋白不吸附或親和力低
首先確認純化前的樣品中是否有目標蛋白。
（1）有目標蛋白，但大量穿透：
a、蛋白不含有標簽或未能正確表達
解決措施：Western Blot鑒定目標蛋白是否有His-Tag。若沒有，需要重新構(gòu)建載體，添加組氨酸標簽，并確認標簽正確表達。
b、蛋白折疊導(dǎo)致組氨酸標簽未完全暴露
解決措施：
在不變性條件下純化蛋白，在樣品和平衡緩沖緩沖液中加1-2M尿素，這樣蛋白結(jié)構(gòu)相對松散，而蛋白不會變性。
在變性條件下純化蛋白，加入4~8M尿素或4~6M鹽酸胍使蛋白變性。如果蛋白有二硫鍵，最好加1-2mM DTT或1~5mM巰基乙醇（在樣品中添加），可以改善蛋白的吸附。
重新構(gòu)建載體，將組氨酸標簽換到另外一端，或在組氨酸標簽基因與目的基因之間增加一段Linker，可以降低蛋白折疊后標簽被掩蓋的幾率。
c、標簽太短  
解決措施：將標簽的組氨酸數(shù)量增加至6-10個。
d、蛋白標簽被水解
解決措施：添加合適的蛋白酶抑制劑；盡量在低溫下處理樣品；對于分泌表達的蛋白，長時間存放將增加蛋白被降解的風險，應(yīng)盡快處理樣品。
e、蛋白溶解度偏低或聚集
解決措施：在結(jié)合緩沖液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100，或5%~50%的甘油，可以增加蛋白的溶解度，減少蛋白聚集。
f、樣品及結(jié)合緩沖液不合適
解決措施：確認樣品及緩沖液中不含有EDTA、還原劑等。另外，將樣品及結(jié)合緩沖液pH調(diào)節(jié)至7.4~8.5，有利于蛋白結(jié)合。
（2）有目標蛋白，但含量很低：
蛋白表達量低。解決措施：對樣品進行濃縮，增加磁珠用量、延長反應(yīng)時間；優(yōu)化表達條件（誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間，培養(yǎng)基等）；或更換其他合適的表達載體或表達系統(tǒng)。

2.純化得到的蛋白量少
（1）磁珠用量不足。本產(chǎn)品磁珠懸液濃度為10%，對于親和力較高的蛋白，每毫升磁珠懸液可結(jié)合的蛋白量約為3~4mg。用戶需要根據(jù)目標蛋白含量，使用足夠量的磁珠。對于親和力較低的蛋白，需要增加磁珠用量，延長反應(yīng)時間，或提高樣品及結(jié)合緩沖液pH。
（2）蛋白與磁珠親和力較低。參考問題1。
（3）蛋白濃度低。對樣品進行濃縮，或增加磁珠用量、延長反應(yīng)時間。
（4）磁珠重復(fù)使用次數(shù)太多。將磁珠進行再生處理（參考產(chǎn)品說明書）。

3.洗脫產(chǎn)物雜帶多什么原因？怎么處理？
（1）雜蛋白吸附。由于組氨酸，色氨酸，半胱氨酸等是蛋白質(zhì)中很常見基團，而蛋白折疊可能導(dǎo)致幾個這樣的氨基酸殘基臨近，這樣也會使它們和磁珠的作用力增加?？梢杂貌煌瑵舛鹊倪溥蜻M行梯度洗脫，在樣品及平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton X-100，或5~50%的甘油，可以避免因為疏水相互作用導(dǎo)致非特異吸附，或使用鈷離子螯合磁珠（BeaverbeadsTM IDA-Cobalt）。此外，要獲得純度較高的蛋白，需要對裂解、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液的組分、pH、咪唑濃度等進行優(yōu)化。若還是不能獲得高純度的蛋白，則需要考慮使用多步純化，結(jié)合使用離子交換、凝聚過濾等純化方法。
（2）菌體破碎條件太劇烈導(dǎo)致蛋白斷裂。確保在冰浴條件下破碎；降低超聲破碎的強度，縮短時間；適當稀釋樣品，添加核酸酶，降低樣品粘稠度。
（3）蛋白被部分水解。添加合適的蛋白酶抑制劑，并盡可能在低溫下操作。

4.目標蛋白難洗脫
穿透組分中目標蛋白明顯減少，而洗脫組分中目標蛋白很少，取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加熱5~10min，離心跑電泳，如果發(fā)現(xiàn)較多蛋白殘留。
（1）洗脫調(diào)節(jié)太溫和。提高洗脫液咪唑濃度至700mM還不能洗脫時，可以嘗試降低洗脫液pH至4.0，但低pH會也導(dǎo)致金屬離子脫落，磁珠需要再生后再使用。
（2）蛋白吸附在磁珠上無法洗脫。對于非特異性疏水吸附的蛋白，可以增加NaCl濃度至1M，或添加0.1%~2%的Triton X-100洗脫。對于聚集沉淀在磁珠上的蛋白（尤其注意含有二硫鍵的蛋白），可以在洗脫緩沖液中加入6M鹽酸胍進行變性洗脫。

5.磁珠再生后，蛋白純化效果變差怎樣改善?
（1）再生過程的堿處理可以改善再生磁珠的蛋白純化效果，參考海貍生物醫(yī)學《組氨酸標簽蛋白純化試劑盒》說明書中磁珠再生部分步驟4。
（2）重新掛金屬離子后為清洗干凈，需要增加洗滌步驟。殘留的金屬離子優(yōu)先跟蛋白結(jié)合，影響蛋白與磁珠的結(jié)合。

6.緩沖液中咪唑添加的意義
（1）結(jié)合緩沖液中低濃度的咪唑是為了減少雜蛋白的非特異性吸附；
（2）洗滌緩沖液中低濃度咪唑是為了吸取吸附能力較弱的雜蛋白；
（3）洗脫液中高濃度咪唑是為了洗脫目的蛋白。

7.IDA-鎳和IDA-鈷的區(qū)別
IDA-鎳的蛋白載量高，40mg/mLgel，純度稍低，純度有90%。
IDA-鈷的蛋白載量稍低,25mg/mLgel,純度達到95%。
一般客戶建議購買IDA-鎳磁珠，即可達到目的。

GST融合蛋白純化篇
1.如何純化GST融合蛋白？

2.可純化蛋白種類

3.磁珠掛不上目的蛋白
以下的處理方案的前提是樣本里面有目的蛋白，如果是包涵體需要變性。
可能一：結(jié)合條件不對
理想的結(jié)合條件為pH 6.5-8.0，純化之前確認磁珠是否采用緩沖液平衡以及蛋白樣本的pH值，低于pH6.5或高于pH8時，融合蛋白與磁珠結(jié)合不充分導(dǎo)致結(jié)合效率低。
可能二：樣本中目的蛋白的濃度偏低
目的蛋白的濃度過低，會嚴重影響磁珠與蛋白的結(jié)合。
兩種方法可供選擇：
a)濃縮蛋白樣本；b)增加磁珠的濃度
可能三：檢查目的蛋白是否聚集沉淀
在細胞裂解前加入DTT，在緩沖液中也加入DTT 。1-20mM的DTT 會顯著增加某些GST融合蛋白的結(jié)合。
可能四：判斷是否是因為GST失活
過度超聲會破壞標簽蛋白而減少其與磁珠的結(jié)合。減少超聲破碎的時間和強度。
可能五：標簽蛋白可能改變了GST 構(gòu)相
降低結(jié)合的溫度來改善結(jié)果。

4.目的蛋白在磁珠上，洗脫不下來
第一步：判斷是否結(jié)合
取Mag beads加loading buffe煮沸，再跑page電泳。
如果確認有蛋白，且載量還很高，那么極有可能是形成了過蛋白沉積。
太多的蛋白沉積在磁珠孔內(nèi)，無法洗脫。建議將目的蛋白樣本稀釋，少量純化。
第二步：調(diào)節(jié)洗脫條件
洗脫緩沖液pH，酸性的都洗不下蛋白。盡量將洗脫液的pH值調(diào)到8.0。

5.洗脫樣本里面有雜蛋白
可能一：非特異性吸附
提高平衡緩沖液中的鹽濃度可以降低因為離子作用帶來的非特異吸附。
在平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton可以避免因為疏水相互作用導(dǎo)致非特異吸附，這些措施都可以電泳的雜帶明顯減少。
可能二：26KD的GST條帶
GST融合蛋白的表達系統(tǒng)很容易表達到GST部分就終止，所以26KD左右的雜帶是很常見的，那可以選擇用不同濃度的還原谷胱甘肽去做階段洗脫，如果還是分不開，那也許就得選擇離子交換或者凝膠過濾等別的分離手段。
可能三：蛋白降解
如果用上述方法還是雜帶多，那就地回頭去看看破碎的條件是不是太劇烈或者溫度控制不好導(dǎo)致蛋白短裂或者分解導(dǎo)致一些蛋白片段帶標簽，或者因為樣品長時間保存導(dǎo)致水解等
可能四：蛋白相互作用
蛋白相互作用形成聚合體，導(dǎo)致雜帶增加，而由于疏水相互作用或者因為離子作用可以通過添加表面活性劑或者增加離子強度得到改善，對于因為形成聚合體的可以在緩沖液和樣品中加1-2mM巰基乙醇避免。

Strep-tag II磁珠

海貍Strep-tag II磁珠可以在生理條件下純化得到使Strep-tag融合蛋白。與其他tag相比，這些溫和的純化參數(shù)能保存蛋白質(zhì)的生物活性，并僅經(jīng)一步層析后即可產(chǎn)出超過99%的純度。

1.Strep-tagII磁珠純化的技術(shù)原理是什么呢？

答：主要基于Strep –tagII多肽與Strep-Tactin（一種經(jīng)過特殊工藝改造的鏈酶親和素）的相互作用，在生理緩沖液或是含有其他添加劑的環(huán)境下，帶有標簽的蛋白與固定化的Strep Tactin親和純化，經(jīng)過加有2.5mM脫硫生物素的同種緩沖溶液中即可溫和地將純化的重組蛋白洗脫下來。 這些溫和的純化參數(shù)能保存蛋白質(zhì)的生物活性，并可獲得純度超過99%的目標蛋白。

2.Strep-tagII的分子量大約是多少？通常在融合蛋白的什么位置？

答：Strep-tagII多肽有8個氨基酸( Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys）分子量約為1KDa.作為標簽可以在蛋白的N端或是C端，也可以作為兩個蛋白域的鏈接，甚至可以用于換種結(jié)構(gòu)中。

3.Strep-tag磁珠的載量如何呢？

答：海貍納米磁珠蛋白結(jié)合量可以達到7mg Strep-tag II蛋白 /mL Gel

4.純化蛋白的純度如何？

答：純度＞95%。但是如果存在重組蛋白非特異性互作就可能降低蛋白純度。為了減少污染，可以再結(jié)合洗滌和洗脫時加入合適的添加劑(如還原劑，鹽，溫和的去污劑)。如果是二硫鍵共價結(jié)合的雜蛋白，可以在緩沖液中加入還原劑。非共價鍵結(jié)合一般采用提高離子強度的方法，常用NaCl或Triton X-100，Tween20和CHAPS等。

5.Strep-tagII磁珠結(jié)合抗生素的蛋白嗎？

答: 不會。

6.洗脫下來的蛋白質(zhì)混有脫硫生物素嗎？

答:沒有，脫硫生物素不會與蛋白結(jié)合貨干擾蛋白分析，而且容易通過透析或是過濾去除。